石蜡切片免疫组化染色常见问题相关知识

 内源性生物素：生物素是一种维生素，作为一种辅酶参与羧化反应。在人体组织中，绝大多数生物素与线粒体丙酮酸盐羧化酶相关，因此，富含线粒体的细胞具有丰富的内源性生物素，如肾脏、肝脏以及一些肿瘤细胞。如果应用生物素/卵白素检测系统，由于卵白素可以和生物素不可逆地强结合，势必会造成非特异性染色，热介导的抗原修复可以显著“复活”内源性生物素，所以更加加剧这种非特异背景染色。解决的方法除了换成非生物素的检测系统外，还可以用以下简单的方法封闭内源性生物素。首先用蛋清中的卵白素（一个鸡蛋清加入到100ml的PBS中）封闭内源性生物素，再用5%奶粉作为生物素替代品（5克奶粉加入100ml的PBS/TBS中）来封闭卵白素中未结合的位点，冲洗后即可加一抗。内源性过氧化物酶天酒地   一般红细胞和嗜中性粒细胞中过氧化物酶含量比较高，会造成非特异性染色。灭活内源性过氧化物酶的方法：0.3%-3%H2O2，用PBS（pH7.4）或蒸馏水或甲醇配制。冲洗步骤免疫组化染色步骤中包括多次冲洗过程，任何一步出现冲洗不干净的问题，都有可能产生背景染色。解决的方法可以在冲洗液中加入吐温20，一般在1000ml的冲洗液中加入0.2ml的吐温20即可。鼠单抗用于鼠组织由于小鼠组织中可能含有内源性IgG，所以检测系统就会识别这些抗体，造成非特异性染色。解决的方法要么封闭内源性IgG，要么直接使用商品化的Mouse-to-Mouse检测试剂盒。固定不及时　　可以造成蛋白弥散，会产生异位染色。干片孵育的过程中没有放入湿盒或加入液体过少或孵育时间过长，都会造成局部（尤其是边缘）干片，应该避免。修复过度抗原热修复（尤其是使用EDTA）有时会造成细胞核异位染色，对于细胞核染色的抗体这种情况应通过对照片加以甄别